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胚胎源外泌体对??寺∨咛ヌ逋夥⒂挠跋?
发布时间:2019-03-20



兽医硕士论文范文第三篇:胚胎源外泌体对??寺∨咛ヌ逋夥⒂挠跋?/strong>

 

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  【题目】胚胎源外泌体对??寺∨咛ヌ逋夥⒂挠跋?br />   【第一章】牛繁殖关键技术研究
  【第二章】体外培养胚胎分泌外泌体的分离与鉴定
  【第三章】培养体外胚胎分泌外泌体对核移植胚胎发育的影响
  【第四章-参考文献】不同量的外泌体对核移植胚胎囊胚率的影响结论

摘要
  
  胚胎在体外培养的发育过程中,在形态、基因表达和发育能力方面不能够达到胚胎在雌性生殖道内的发育的水平,因此优化培养液成分仍然是非常迫切需要。牛胚胎体外培养时,需要培养 7 天发育到囊胚,然后进行胚胎移植。通常采用第 3.5 天更换胚胎培养液,然而更换培养液对胚胎的影响仍然不清楚。
  
  采用超速离心法提取胚胎培养液中的外泌体,采用投射电子显微镜和免疫荧光染色外泌体特异性蛋白 CD9 鉴定外泌体,发现胚胎在体外培养过程中能够分泌外泌体,换液会导致胚胎分泌外泌体丢失。用 30 μL 新鲜培养液重悬从 10m L 第 3.5 天胚胎培养液提取的外泌体。将不同量(1μL、5μL 和 10μL)的胚胎外泌体提取物添加到胚胎培养液中,添加 5μL 和 10μL 外泌体提取物能够显着提高胚胎体外发育的囊胚率。将胚胎分为三组培养,分别是换液组(第 3.5 天换液)、不换液组(全程不换液)和外泌体添加组(第 3.5 天换液并添加 5μL 外泌体提取物)?;虮泶锝峁砻骰灰河跋炫咛シ⑸谥释?、凋亡和内细胞团和滋养层细胞分化。添加外泌组的 Oct4 基因的表达水平显着高于换液组,这表明换液导致丢失的胚胎分泌的外泌体在内细胞团和滋养层细胞分化过程中发挥重要的作用。
  
  本研究发现核移植胚胎体外培养过程中,换液导致胚胎外环境发生剧烈变化诱发胚胎发生内质网应激与凋亡,不利于胚胎发育;换液过程中导致胚胎分泌的外泌体丢失,影响核移植胚胎内细胞团和滋养层细胞分化;胚胎分泌的外泌体在调控胚胎体外发育中发挥重要的作用。本研究对优化胚胎的体外培养,提高克隆效率,为提高牛繁殖育种效率提供技术支撑。
  
  关键词:外泌体;胚胎;体细胞核移植;体外培养;发育
胚胎
 
ABSTRACT
  
  The  developmental  competence  of  in  vitro  cultured  (IVC)  embryos  is  markedly  lowerthan that of their in vivo counterparts, suggesting the need for optimization of IVC protocols.
  
  Embryo  culture  medium  is  routinely  replaced  three  days  after  initial  culture  in  bovine,however,  whether  this  protocol  is  superior  to  continuous  nonrenewal  culture  method  undercurrent conditions remains unclear.
  
  Exosomes  in  embryo  culture  medium  were  extracted  by  ultracentrifugation.  Theexosomes  were  identified  by  electron  microscopy  and  immunofluorescence  staining  withexosome specific protein CD9. The results showed that the exosomes could be secreted by theembryo during in vitro culture, and the exosomes would be lost by changing embryo culturemedium.  The  exosomes  extracted  from  10  m L  embryo  culture  medium  on  day  3.5  weresuspended  in  30  u L  fresh  culture  medium.  Adding  5  u L  and  10  u L  groups  showedsignificantly  higher  blastocyst  rates  than  the  control  group  and  1u L.  Also  embryos  weredivided into three groups, renewal group (renewed on 3.5 days), non-renewal group (withoutrenewal  during  IVC)  and  supplementary  group  (supplemented  exosomes  on  3.5  days  duringrenewal)。 The results of gene expression showed that renewal affected endoplasmic reticulumstress,  apoptosis  and  differentiation  of  inner  cell  mass  and  trophoblast  cells.  The  expressionlevel  of  Oct4  gene  in  the  supplementary  group was  significantly  higher  than  that  in  renewalgroup,  suggesting  that  exosomes  secreted  by  embryos  play  an  important  role  in  thedevelopment of inner cell mass and trophoblast cells.
  
  In this study, we found that renewal induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis,which  was  not  conducive  to  embryonic  development;  during  the  process  of  renewal,  theexosomes secreted by embryos were lost, which affected the differentiation of inner cell massand trophoblast cells. This study will provide technical support for optimizing embryo culturein vitro, improving cloning efficiency and improving reproductive and breeding efficiency ofcattle.
  
  KEY  WORLD:  Exosome;  Embryo;  Somatic  cell  nuclear  transfer;  in  vitro  cultured;development

目  录

  第一章综述
  1.1牛繁殖关键技术研究进展
  1.1.1人工授精
  1.1.2超数排卵与胚胎收集
  1.1.3胚胎移植
  1.1.4胚胎培养
  1.1.5基因编辑技术
  1.1.6体细胞核移植

  1.2外泌体研究进展
  1.2.1外泌体的生理作用
  1.2.2外泌体在疾病发生中的作用
  1.2.3外泌体在诊断中的作用
  1.2.4外泌体在治疗中的作用
  1.2.5外泌体的分离纯化和储存

  第二章体外培养胚胎分泌外泌体的分离与鉴定
  2.1试验材料与方法
  2.1.1试验材料
  2.1.2试验方法
  2.2试验结果
  2.2.1核移植胚胎体外培养分泌外泌体的电镜结构
  2.2.2核移植胚胎体外培养分泌外泌体的免疫荧光检测
  2.3讨论
  2.4小结

  第三章体外培养胚胎分泌外泌体对核移植胚胎发育的影响
  3.1试验材料与方法
  3.1.1试验材料
  3.1.2试验方法
  3.2试验结果
  3.2.1不同量的外泌体对核移植胚胎囊胚率的影响
  3.2.2换液、不换液和添加外泌体对核移胚胎基因表达的影响
  3.2.3换液、不换液和添加外泌体对核移胚胎体外培养囊胚率的影响
  3.3讨论
  3.4小结

  结论
  参考文献

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